***效价的微生物检定室要求

点击次数：2783 发布时间：2015-04-16

***效价的微生物检定室用途及要求：***效价的微生物检定室用途在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测***对微生物的抑制作用，计算***活性（效价）。

***效价的微生物检定室用途及要求《中国药典》[1]对***效价的微生物检定室的环境洁净度未有明确规定要求在国家食品药品监督管理局2000年9月颁发的《药品检验所实验室质量管理规范（试行）》中第十八条中规定有“***微生物检定实验室分为半无菌操作间和缓冲间。半无菌操作间设有紫外线灯，操作台宜稳固，并保持水平。实验室内应光线明亮，并有控制温度、湿度的设备”。通常按洁净度100 000级设计。
仪器用具与试药
双碟、陶瓦盖、钢管（牛津杯）、钢管放置器、抑菌圈测定仪、超净工作台、恒温培养箱、滴管、天平、玻璃容器、天平、一次性塑胶手套
2.1.1.1 仪器与用具
***效价的微生物检定操作室：光线明亮，操作室应分为两部分，彼此分开，其中一部分为一般操作室，一部分为半无菌操作室。半无菌操作室应设有紫外线**灯，并附设空气净化（空气净化级别为100～10000级）及空调设备，控制室温度在20~25℃之间，达到无菌或半无菌状态。操作台应稳固，台面用玻璃板，并用水平仪调节至水平。注意操作，避免室内***污染。
双碟：内径约90mm高16～17mm硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡。碟底平度检查，可将双碟放在水平台上，下垫一张白纸碟内加水2～3ml，再滴加蓝墨水，观察蓝色深浅是否一致。
陶瓦盖：内径约203mm，外径108mm，平坦，吸水性强，应定期清洗、干燥或干热**。
钢管：内径（6.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm，外径（8.0±0.1）mm或（7.8±0.1）mm，每套钢管重量差异不超过±0.05g，内外壁及两端平坦，管壁厚薄一致。每次使用后应置1:1000新洁尔灭溶液内，浸泡2h以上，**后再洗涤，先用水洗涤，超声波超声30min后用沾有去污粉的纱布条串擦内外壁，水冲洗，沥干，再用蒸馏水冲洗3次后，置带盖的容器内，在150～160℃干热**2h，备用。
钢管放置器（牛津杯）：有6孔和4孔两种。放置于无菌或半无菌的操作平台上，钢管下落时应垂直平稳、位置正确。双碟升降平稳。应保持清洁，防止***污染。可定期用75%乙醇棉擦拭落管筒及储管杯。置钢管的玻璃管应定期干烤**。
恒温培养箱：以隔水式为宜，温度平稳，波动小。除另有规定外，依各品种项下要求设定温度，温度波动范围为35～37℃或24～26℃，箱内网状隔板上放置带孔的玻璃板并调节至水平。
**刻度吸管：用于吸取菌液及培养基。用后应立即置5%石炭酸或1:1000新洁尔灭溶液中**后，再按玻璃容器的常规洗涤法洗涤。洗涤沥干后在吸口处塞入脱脂棉（松动、透气），置适宜容器中，在120℃以上干热**2h或121℃蒸气**30min，烘干备用。
玻璃容器：包括定量移液管、刻度吸管、容量瓶等，均应符合“常用玻璃量器国家计量检定规程”的规定。每次使用前用清洁液浸泡，水冲洗，并用蒸馏水或去离子水冲洗3次，沥干。
称量瓶：重量在10g以下。用毕先用水冲洗，沥干，置清洁液浸泡2h以上，然后分别用水、蒸馏水或去离子水冲洗3次，置洁净平皿中，在120℃干热**3h，待冷置60～70℃时，取出置于干燥器中备用。
滴管：用玻璃管拉制，管口平滑。使用前在清洁液浸泡，分别用水、蒸馏水或去离子水冲洗3次，置适宜容器中，在120℃干热**3h后，备用。
天平：分析天平，精密度0.1mg，经计量检定。
抑菌圈直径（面积）测量仪： 应符合“抑菌圈测量仪检定规程”的规定。
游标卡尺：精度0.02mm，长度150mm。
超净工作台：有效工作面局部洁净度100级。用于试验菌的接种传代或菌悬液制备。超净工作台须置洁净工作室或半无菌室内。
    ***微生物检定方法
    ***微生物检定法系在适宜条件下，通过检测***对微生物的抑制作用，计算***活性(效价)的方法。依试验设计原理不同，可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法。后二者被列为***微生物检定的国际通用方法。中国药典也采用这两种方法。
    ***微生物检定管碟测定法系琼脂扩散法，是利用***在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度***球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。此法系根据***在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径(面积)呈直线关系而设计，通过检测***对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
    ***微生物比浊法是将一定量的***加至接种有试验菌的液体培养基内，混匀后，经培养，测量培养基的浊度。此法系根据***在一定的浓度范围内，其浓度或浓度的数学转换值与试验菌生长产生的浊度(浊度与**数量、**群体质量及**细胞容积的增加之间存在直接关系)之间存在线性关系而设计，通过测定培养后**浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，计算出供试品的效价。     ***效价以“单位(u)”或“微克(μg)”表示。

管碟法的操作步骤：

1、预试验：确定*佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、***终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。

2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及**；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外**等。

3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。

4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。

5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。

6、滴加***溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。

7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。

8、抑菌圈的测量：抑菌圈测量仪的使用，每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。手工测量：游标卡尺

9、结果的可靠性检验及效价测定：抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结果。

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